1 儀器與試劑 

1.1 儀器 

BSA2214 型天平(賽多利斯)，SK8210LHC 型超聲波清洗儀(上 ?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)，DGG-9070A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 (上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，WFZ UV-2000 型紫外可見分光光 度計(jì)(尤妮柯(上海)儀器有限公司)，JY1002 電子天平(上海舜宇恒 平科學(xué)儀器有限公司)，SSW 型微電腦電熱恒溫水槽(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。 

1.2 試藥 

預(yù)處理過的石蛙皮、L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(上海金穗生物科技有 限公司)、對二甲氨基苯甲醛、高氯酸溶液、冰乙酸、正丙醇、正 丁醇、異丙醇、氯胺T、Na2CO3等均為分析純。 

2 方法與結(jié)果 

2.1 原理 

該方法源于國標(biāo) GB/T9695-23-2008。樣品用硫酸在高溫下水 解，氧化羥脯氨酸，加入對二甲氨基苯甲醛顯色，在 558nm 波長 下進(jìn)行測定。膠原蛋白含量%=試樣中羥脯氨酸的含量*11.1。 

2.2 試劑 

2.2.1 氯胺 T 溶液的配制 

稱取 0.7g 氯胺 T，并用 50 mL 緩沖溶液溶解。 

2.2.2 緩沖溶液(pH=6.8)的配制

 一水檸檬酸 26.0g，氫氧化鈉 14.0g 和無水乙酸鈉 78.0g，并 500 mL 水溶解上述所配試劑移入 1L 的容量瓶中，再加入 250 mL 正丙醇，用水定容。 

2.2.3 顯色劑的配制 

稱取 2g 對二甲氨基苯甲醛，并用 7 mL 的高氯酸溶液(60%(質(zhì) 量分?jǐn)?shù)))溶解，緩慢加入 13 mL 異丙醇。該試液必須在臨用前配 置。

2.2.4 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液的配制 

首先稱取 50.1mg 羥脯氨酸于 100 mL 量瓶中，用水溶解，再 加硫酸溶液，用水定容。 

2.2.5 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液液的配制 

先移取 2.50 mL 所配的羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液至 250 mL 量瓶中，用 水定容。分別精密吸取該溶液 5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL 置 50 mL 量瓶中，水定容，所得羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度 依次為 0.501 μg/mL、1.002μg/mL、1.503μg/mL、2.004μg/mL、2.505μg/mL。該試液在臨用前配用。 

2.3 樣品的處理

 (1)稱取 2.2g 試樣于燒瓶中，應(yīng)避免試樣粘在燒瓶壁；再量取 30 mL 的硫酸溶液(3mol/L)，加入燒瓶中，用表面皿蓋住，恒溫于 105℃的干燥箱中 16h。趁熱過濾至 250 mL 量瓶中，并用 10 mL 硫酸溶液洗滌，洗滌液并入量瓶中，用水定容，搖勻。精密移取 4 mL 酸水解液至 250 mL 量瓶中，定容，搖勻，即得。 (2)移取 4 mL 樣品溶液于比色管中，加入 2 mL 氯胺 T 試劑， 混合后，于室溫下放置 20min。在比色管中加入 2.00 mL 顯色劑， 混合，封住比色管的瓶口并迅速放入 60℃水浴中加熱 20min。取 出比色管，用流動(dòng)水冷卻比色管不少于 3min，在室溫下靜置 30min。取上述澄清液體，用水作參比，于 558nm 處用分光光度 計(jì)測定吸收值，將檢測出的吸收值扣除空白溶液的吸收值，從 3.5 所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到羥脯氨酸的含量。

3 膠原蛋白的提取工藝條件篩選 

在料液比 1∶15(溶劑為 0.5mol/L 的乙酸溶液)下，加入石蛙 皮質(zhì)量 2.5‰的胃蛋白酶，提取 24h，溫度分別在 10℃、15℃、20℃、 25℃、30℃、35℃時(shí)進(jìn)行提取。當(dāng)溫度由 10℃上升到 25℃過程中，膠原蛋白得 率上升幅度明顯；當(dāng)提取溫度再繼續(xù)上升，膠原蛋白得率緩慢增 加。據(jù)有關(guān)報(bào)道，水產(chǎn)膠原蛋白變性溫度較低，大約在 37°左右， 基于這一點(diǎn)，石蛙皮中膠原蛋白的提取溫度選擇 25℃為宜。酶濃度的變化對石蛙皮中膠原蛋白得率有一定 的影響，當(dāng)酶的添加量上升，膠原蛋白得率也不斷增加，直到酶 的添加量達(dá)到 3‰之后，膠原蛋白得率基本趨于穩(wěn)定，不再顯著 上升，所以確定酶添加量的最佳值為 3‰。

4 討論

 (1)通過對石蛙皮中的膠原蛋白的提取，利用酸酶結(jié)合的方 法，以及利用紫外分光光度計(jì)檢測羥脯氨酸的含量，最終換算出 蛙皮中膠原蛋白的得率。但其試驗(yàn)并沒有測出膠原蛋白的類型， 也需要更進(jìn)一步的精制。 (2)同時(shí)在進(jìn)行紫外分光檢測時(shí)，觀察到部分溶液由混濁現(xiàn) 象，則應(yīng)該等溶液反應(yīng)澄清或使用超聲波促進(jìn)溶解，過濾或加熱 處理，待溶液澄清了再進(jìn)行測定。 (3)實(shí)驗(yàn)研究了對提取膠原蛋白的多種影響因素，經(jīng)過篩選， 提取工藝為：胃蛋白酶加入量為 3.0‰；酶解溫度為 25℃；酶解 時(shí)間為 24h；料液比為 1∶20。該工藝穩(wěn)定可行，可用于石蛙皮中 膠原蛋白的提取。

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