白色念珠菌是一種條件致病性真菌，通常情況 寄生于人體的口腔、腸道、陰道以及皮膚的表面。念 珠菌的存在與機(jī)體的微生物（如細(xì)菌、病毒等）是處 于共生互利的狀態(tài)，但當(dāng)人體患有某些疾病（如腫 瘤、癌癥、糖尿病等）時(shí)，免疫功能的降低易引起菌 群失調(diào)，甚至?xí)鸷粑⑾裙δ艿漠惓?。?些年感染系統(tǒng)性白色念珠菌的越來越多，其原因頗 多，例如激素、使用免疫抑制劑包括大量使用一些抗 腫瘤等藥物，致使機(jī)體對(duì)抗白色念珠菌的感染能 力下降，致使菌群失衡患者的發(fā)病率及病死率顯著 上升。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

四君子湯（人參9 g，白術(shù)9 g，茯苓9 g，甘草6 g）， 購買于沈陽市皇姑區(qū)成大方圓藥房，依照傳統(tǒng)的方 法將其制成水煎制劑。先將中藥用蒸餾水浸泡 2 h， 加熱煮沸改為文火 15 min，濾出藥液，再次加入蒸餾 水煎 20 min，將 2 次藥汁混勻，放置 4 ℃冰箱。 甘藍(lán)洗凈放好，肥豬油用鍋熬制好，放置 4 ℃冰 箱。 氟康唑膠囊，石家莊四藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)： H10970299。生理鹽水將其溶解之后制成混濁液， 調(diào)整至藥物濃度為 0.4 mg/mL（10 mg/kg）。 白色念珠菌的菌株是由北京大學(xué)第一醫(yī)院贈(zèng) 與，Candida albicans（03382 株）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

小鼠購買于遼寧長生生物科技有限公司的 SPF 級(jí)昆明種，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生產(chǎn)許可證號(hào)為：SCXK（遼） 2010-0001。將購買的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于具有 SPF 級(jí) 動(dòng)物室的實(shí)驗(yàn)中心內(nèi)，即遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物室的 許可證號(hào)：SYXK（遼）2013-0009。 1.3 試劑與器材 anti-IFN-γ：abcam 公司產(chǎn)品，批號(hào)：ab24979。 Western-blot 試劑均購于碧云天生物技術(shù)有限 公司，其中包括：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量，批號(hào)：P0062； 蛋 白 標(biāo) 準(zhǔn)，批 號(hào)：P0007；BCA 蛋 白 濃 度 測 定 試 劑 盒，批 號(hào)：P0012；Western 及 IP 細(xì) 胞 裂 解 液，批 號(hào)： P0013；SDS-PAGE 凝膠配置試劑盒，批號(hào)：P0012A； Western-blot 蛋白上樣緩沖液，批號(hào)：P0015L；超敏 ECL 化學(xué)發(fā)光液試劑盒，批號(hào)：P0018；Western- 抗 體稀釋液，批號(hào)：P0023A。 電子天平選用上海舜宇恒平科學(xué)儀器（JA2003 型），生物安全柜選用青島海爾特種電器（HR40- IIA2 型），上海博迅YXQ-75SII立式壓力蒸汽滅菌器，全自動(dòng)凝膠圖像分析選用上海天能 （Tanon-4200SF 型）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 接種菌液的配制

在高溫高壓滅菌后的沙堡培養(yǎng)基上將白念 珠菌株轉(zhuǎn)種培養(yǎng) 2~3 次，放入 37 ℃恒溫箱中培養(yǎng) 24 h。選用無菌生理鹽水將其轉(zhuǎn)種后的念珠菌 進(jìn)行稀釋，取一滴稀釋好的懸液滴在 16×25 計(jì) 數(shù)板上，然后進(jìn)行計(jì)數(shù)，最終將菌液調(diào)整為 2× 108 CFU/mL。

2.2 分組、制造模型及處理方法

正常飼養(yǎng) 1 周后，采用隨機(jī)分成法將小鼠分 為 5 組，即空白對(duì)照組（A）、脾虛模型組（B）、脾 虛 + 白念珠菌組（C）、脾虛 + 白念珠菌 + 氟康唑 組（D）、脾虛 + 白念珠菌 + 四君子湯組（E），每組 10 只。除空白對(duì)照組（A）10 只小鼠以外，其余參 照文獻(xiàn)將采用復(fù)合因素法制備脾虛模型，單日 游泳直到耐力極限，身體蜷縮，喂生甘藍(lán)，正常飲 水，雙日灌胃豬油 0.5 mL/ 只，連續(xù)造模 14 d。參 照脾虛造模診斷的宏觀標(biāo)準(zhǔn)對(duì)脾虛模型小鼠 進(jìn)行評(píng)估。若模型小鼠出現(xiàn)體重降低，肛門周邊 有稀便甚至出現(xiàn)便溏，食少納呆，疲乏無力，毛色 枯槁，卷縮扎堆等表現(xiàn)，提示脾虛制造模型成功。 造模成功的次日經(jīng)口感染白念珠菌懸液給 C、D、 E 組的小鼠 0.5 mL/ 只（濃度為 2×108 只 /mL），而 A、B 組給以 0.5 mL/ 只生理鹽水。

2.3 給藥方法

經(jīng)口感染白色念珠菌的次日開始灌胃治療，脾 虛 + 白念珠菌 + 氟康唑組（D）小鼠給予氟康唑灌胃 治療，脾虛 + 白念珠菌 + 四君子湯組（E）組小鼠給 予四君子湯灌胃治療。每日 1 次，連續(xù) 2 周。

2.4 指標(biāo)檢測

2.4.1 觀察四君子湯對(duì)脾虛小鼠感染白色念珠菌后

小腸組織中IFN-γ含量的影響 治療的第 14 天斷髓處死后取出小鼠小腸的空 腸 段 0.1 g，用 PBS 沖 洗 干 凈，放 置 于 1.5 mL EP 管 中，-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。提取每組小鼠小腸組織 中總蛋白，采用western-blot法檢測其IFN-γ蛋白含 量的表達(dá)。首先檢測其蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度，用 上樣液調(diào)整好上樣的量，最終蛋白的量為15 μg/孔， 在電壓 80 V/120 V 條件下開始跑膠，大約 2 h 左右， 關(guān)閉電源。將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至濾膜上，采用濕 轉(zhuǎn)，100 V 轉(zhuǎn)移 1.5 h。抗原抗體∶一抗（1∶500）、二 抗（1∶1500）放置在 4 ℃冰箱里進(jìn)行孵育過夜后，第 2 天顯色，等體積的 ECL 每膜 1 mL，用自動(dòng)凝膠圖像 分析系統(tǒng)進(jìn)行拍攝，測其條帶的灰度值，將其數(shù)統(tǒng)計(jì) 分析。

2.4.2 觀察四君子湯對(duì)脾虛小鼠感染白色念珠菌后

小腸組織中IFN-γmRNA含量的影響 治療的第 14 天斷髓處死后取出每只小鼠小腸 的空腸段 0.1 g，用 PBS 沖洗干凈，放置于 1.5 mL EP 中，-80 ℃冰箱凍存，待檢。對(duì)每組小鼠小腸組織中 IFN-γmRNA 的含量選用 RT-PCR 法進(jìn)行檢測。首 先進(jìn)行總 RNA 提取，及 RNA 濃度和純度測定，之后 進(jìn)行 cDNA 的逆轉(zhuǎn)錄合成和 PCR 反應(yīng)，最后用瓊脂 糖凝膠進(jìn)行電泳。將凝膠成像用全自動(dòng)凝膠圖像分 析系統(tǒng)進(jìn)行分析，測定每條條帶的積分光密度值，記 錄數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 對(duì)每組數(shù)據(jù)選用 SPSS10.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。 小鼠腸組織當(dāng)中的 IFN-γmRNA 及蛋白含量采用 x —±s 表示，P<0.05 被認(rèn)為有顯著性差異。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如實(shí)驗(yàn)結(jié)果示：與 A 組比較，B 組蛋白表達(dá) 水平顯著升高（P<0.05），C、D、E 組小鼠腸組織 當(dāng)中 IFN-γ 蛋白的含量在治療后均顯著升高 （P<0.01）。 與 B 組 比 較，C 組 小 鼠 小 腸 組 織 中 IFN-γ 蛋白的含量顯著升高（P<0.01），D、E 組小 鼠小腸組織中 IFN-γ 蛋白的含量在治療后均升 高（P<0.05）。與 C 組比較，D 組、E 組鼠小腸組織 中 IFN-γ 蛋白的含量在治療 14 d 后均無統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義。與 D 組比較，E 組小鼠腸組織當(dāng)中 IFN-γ 蛋白的含量在治療 14 d 后無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如實(shí)驗(yàn)結(jié)果示：與 A 組比較，B、C、D、E 組小鼠 腸組織當(dāng)中 IFN-γmRNA 的含量在治療后均明顯 升高（P<0.01），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與 B 組比較，C、D、 E 組小鼠腸組織中當(dāng) IFN-γmRNA 的含量在治療后 均升高（P<0.01），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與 C 組比較，D 組、E 組小鼠小腸組織中 IFN-γmRNA 表達(dá)水平均 無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 討論

“內(nèi)傷脾胃，百病由生”，脾居中焦，主運(yùn)化水谷 精微，氣血生化之源，氣機(jī)升降之樞紐。若脾臟 出了問題，即不能化生氣血，升降功能又失調(diào)，就會(huì) 影響正氣。一些研究者發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)臟象學(xué)描述的 “脾”，從它的位置、形態(tài)上來看，實(shí)際就是我們現(xiàn)代 解剖學(xué)中的脾和胰等，而且這些組織和器官都是幫 助機(jī)體消化、提高機(jī)體免疫功能的器官和組織學(xué)基 礎(chǔ)，因此說明脾有防御功能，若脾氣虛弱導(dǎo)致防 御能力下降，則“百病由生”。而脾虛證大多指的 是脾氣功能不足、不能運(yùn)化、失其健運(yùn)等。四 君子湯為經(jīng)典治療脾虛方劑，對(duì)于腸道菌群失調(diào)研 究也頗多。而目前研究者發(fā)現(xiàn)，白色念珠菌的易 感染性與機(jī)體的免疫防御功能有關(guān)，當(dāng)機(jī)體免疫功 能降低時(shí)發(fā)生白色念珠菌感染，會(huì)引起機(jī)體內(nèi)細(xì)胞 因子含量的變化，部分疫功能也受到一定程度的抑制。