急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）是一種惡性血液系統(tǒng)腫瘤疾病， 也是兒童時(shí)期最常見的惡性腫瘤，占兒童惡性腫 瘤的 35%。ALL 的臨床癥狀主要表現(xiàn)為貧血、肝 脾腫大及免疫能力低下，對患者健康危害嚴(yán)重 。 ALL 的發(fā)病機(jī)理較為復(fù)雜，對其機(jī)理目前尚未完 全明確。microRNA 是一類存在于真核細(xì)胞中的 非編碼小 RNA 分子，可特異性的抑制某些 mRNA 的表達(dá)，從而對細(xì)胞的生長、凋亡等重要生理活 動(dòng)產(chǎn)生作用 。

材料和方法

試劑及儀器

TRIzol 試劑購自美國 Invitrogen 公司；胎牛血清購 自美國 Hyclone 公司；ECL 試劑盒購自武漢艾美 捷科技有限公司；增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、 Caspase 3、Cyclin D1 及 MMP-9抗體均購自美國 Cell Signaling 公司；PVDF 膜購自美國密理博公司； 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自北京索萊寶 科技有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自上 海威奧生物科技有限公司；FACSCanto 流式細(xì)胞儀 購自美國 BD 公司；DYCZ-24A 型雙垂直電泳儀購自北京六一儀器廠；PCR 系統(tǒng)購自瑞士 Roche 公 司；超凈工作臺(tái)購自上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱購自上海精密儀器儀表 有限公司。 臨床標(biāo)本采集 2018 年 5 月至 2018 年 11 月在本院確診的 ALL 患 兒 23 例，其中男 14 例，女 9 例，年齡 8.9 ±2.3 歲， 參照張之南主編《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行 診斷?；純杭覍倬炇鹬橥鈺?，且本研究經(jīng) 醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。患兒的骨髓樣本均在治療 前采集，以防止藥物對骨髓樣本的干擾。采集患 兒骨髓樣本 2 m1 后，置于含 K2EDTA 的抗凝管中， 加入 Ficoll 分離液進(jìn)行密度梯度離心，以提取骨髓 單個(gè)核細(xì)胞（BMNC），置于液氮保存。 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 采用含 10% 胎牛血清、5 μg/ml 青鏈霉素的 RPMI 1640 培養(yǎng)液，置于 37 ℃、5% CO2 的保溫箱培養(yǎng)， 每 2-3 d 傳代 1 次。細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟：將 BMNC 接種 至 24 孔 板， 分 為 對 照 組（Control 組），miR-221 陰 性 對 照 組（miR-221-NC 組）及 miR-221 轉(zhuǎn) 染 組（miR-221 組），待細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期，按照 Lipofectamine 2000 試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作， 并于 37 ℃、5% CO2 條件下培養(yǎng)。 ALL 細(xì)胞 miR-221 水平的 RT-PCR 檢測 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng) 24 h，采用 TRIzol 試劑盒提 取細(xì)胞總 RNA，檢測 RNA 純度后，通過逆轉(zhuǎn)錄試 劑盒合成 cDNA。按照 miRNA 熒光定量 PCR 試劑盒說明書檢測 miR-543 水平，以 U6 為內(nèi)參，miR221 上 游 引 物：5′-CTGACTGCGTCACTGC-3′； 下 游 引 物：5′-CTGACGTGCAGTGCAC-3′。U6上游 引物：5′-GCGTACTGCGTGCATC-3′；下游引物： 5′-GACACTGCAGTCACTC-3′。PCR 反應(yīng)步驟為： 95 ℃ 2 min；然后 95 ℃ 30 s，62 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s， 共 32 個(gè)循環(huán)，采用 2- △△ Ct 法計(jì)算基因的相對水平。

結(jié) 果

轉(zhuǎn)染后各組 ALL細(xì)胞的 miR-221水平 miR-221 組的 miR-221 的表達(dá)水平顯著高于對照組 及 miR-221-NC 組（P＜ 0.05）（圖 1）。

轉(zhuǎn)染后 ALL 細(xì)胞增殖水平的變化 轉(zhuǎn)染 2、3、4 和 5 d 后，miR-221 組 BMNC 細(xì)胞增 殖水平顯著低于對照組及miR-221-NC組（P＜ 0.05） （圖 2）。

討 論

ALL 是兒童時(shí)期較為常見的血液疾病，臨床癥狀 主要表現(xiàn)為免疫功能減弱、貧血、發(fā)熱及血小板 數(shù)量下降等 。在 ALL 治療過程中，由于需要長期的化療干預(yù)，往往會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)，對患兒健 康及生活也產(chǎn)生嚴(yán)重危害，有臨床研究發(fā)現(xiàn)，兒 童急性淋巴細(xì)胞白血病治愈率較低，且容易復(fù)發(fā)， 嚴(yán)重影響治療效果 。乳腺癌患者 的腫瘤組織中 miR-221 水平顯著下降，這與患者預(yù) 后密切相關(guān)。miR-221 在肺癌、肝癌等多種癌細(xì) 胞中表達(dá)水平顯著下降，通過上調(diào)細(xì)胞中 miR-221 水平，可抑制癌細(xì)胞增殖及遷移。因此，需 進(jìn)一步分析 miR-221 對 ALL 細(xì)胞抑制效果，以期 為提高患兒治療效果提供實(shí)驗(yàn)參考。