近年來(lái)，惡性腫瘤的發(fā)病率和病死率均逐年上升， 癌癥已成為我國(guó)居民的第一位死亡原因，疾病負(fù)擔(dān)沉重 。目前，臨床上使用的抗腫瘤藥普遍存在治療窗窄、 藥品不良反應(yīng)相對(duì)較大、采用沖擊療法易導(dǎo)致過(guò)量中毒 等問(wèn)題。而研究發(fā)現(xiàn)，一些天然藥物能夠抑制腫瘤的 生長(zhǎng)，對(duì)腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)有一定的抑制效果，且對(duì)放 療、化療具有“增效減毒”的作用 ，具有較大的開(kāi)發(fā)研究 價(jià)值。三脈菝葜（Smilax trinervula Miq.）為菝葜科菝葜 屬植物，主要分布于我國(guó)江西、浙江、福建等地，亦分布 于日本 。

1 材料

1.1 儀器

MK-Ⅱ型酶標(biāo)儀、3111 型二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó) Thermo Scientific 公司）；TS100-F 型倒置顯微鏡（日本 Nikon 公司）；RE-5205 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀 器廠）；DZF-6030B型真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有 限公司）；HHS-11-2型電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；TDZ4A-WS型低速臺(tái)式離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心 機(jī)儀器有限公司）；SW-CJ-2F 型潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰 空氣技術(shù)有限公司）；BS124S型萬(wàn)分之一天平[奧多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

三脈菝葜藥材于 2016 年 9 月份采自江西省宜豐縣 黃崗山墾殖場(chǎng)，由江西中醫(yī)藥大學(xué)黃慧蓮教授鑒定為百 合科植物三脈菝葜（S. trinervula Miq.）的根莖；DMEM 高糖培養(yǎng)基（美國(guó) Hyclone 公司，批號(hào)：AAJ207791）；胎牛血清（浙江杭天生物科技股份有限公司，批號(hào)： 20170124）；MTT（批號(hào)：303HC510）、試驗(yàn)用順鉑粉末 （批號(hào)：320B022，純度：≥98.5％）、胰蛋白酶-EDTA消化 液（批號(hào)：20170623）、青鏈霉素混合液（100×）（批號(hào)： 20170625）、二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)：20180608）均購(gòu) 自北京索萊寶公司；試驗(yàn)用環(huán)磷酰胺粉末（上海阿拉丁 生化科技股份有限公司，批號(hào)：L1729054，純度：97％）； 乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán) 化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

1.3 動(dòng)物

健康SPF級(jí)KM小鼠，♂，體質(zhì)量（20±2）g，90只， 由江西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許 可證號(hào)：SCXK（贛）2018-0003。小鼠購(gòu)入后，SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 飼養(yǎng)，飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)期間予以自由攝食和飲水，并觀察小 鼠飲食和毛發(fā)狀況。飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)期間的操作符合國(guó)家 科學(xué)技術(shù)部頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.4 細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞株HepG2、人肺癌細(xì)胞株A549、人乳腺 癌細(xì)胞株 MCF-7 和 MDA-MB-231、人宮頸癌細(xì)胞株 HeLa、人卵巢癌細(xì)胞株 HO-8910 以及小鼠肉瘤細(xì)胞株 S180均來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫(kù)。

2 方法

2.1 三脈菝葜醇提取物及其各極性部位萃取物的制備

稱取干燥的三脈菝葜根莖14 kg，切碎，用70％乙醇 加熱回流提取3次，每次1 h，過(guò)濾后合并濾液，減壓濃縮 至無(wú)醇味，得到三脈菝葜提取物總浸膏 740 g（得率： 5.286％）。取總浸膏675 g混懸于適量的蒸餾水中，依次 用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，減壓濃縮后分別 得到三脈菝葜醇提物各部位萃取物浸膏：石油醚部位萃 取部位 5.5 g（得率：0.043％）、乙酸乙酯部位萃取部位 65.9 g（得率：0.516％）、正丁醇萃取部位 123 g（得率： 0.963％）；并將余下的水液減壓濃縮，得到三脈菝葜醇提 物水層部位372.2 g（得率：2.915％）。

2.2 待測(cè)樣品溶液的制備

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，分別稱取三脈菝葜醇提物浸膏 200 mg、醇提物石油醚萃取部位和醇提物乙酸乙酯萃取 部位浸膏各50 mg、醇提物正丁醇萃取部位浸膏100 mg 和水層部位浸膏 200 mg，置于 1 mL 不同量瓶中，用 DMSO溶解并定容至1 mL，得到不同質(zhì)量濃度（均以浸膏量計(jì)）的母液：三脈菝葜醇提物為200 mg/mL、醇提物 石油醚萃取部位和醇提物乙酸乙酯萃取部位均為 50 mg/mL、醇提物正丁醇萃取部位為100 mg/mL、醇提物水 層部位為 200 mg/mL。取上述母液，用 0.22 μm 微孔過(guò) 濾器過(guò)濾后，置于4 ℃冰箱中保存，備用。臨用前，取適 量溶液用完全培養(yǎng)基（含1％青鏈霉素混合液和10％胎 牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基）稀釋到所需質(zhì)量濃度。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

從－80 ℃冰箱中取出各細(xì)胞株，將凍存管置于 37 ℃水浴鍋中水浴約1 min，完全解凍后，轉(zhuǎn)入含5 mL 完全培養(yǎng)基的離心管中，以1 000 r/min離心3 min，棄上 清液，加入6 mL完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、含5％CO2培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)，復(fù)蘇后24 h更換培養(yǎng)基，之后每2～3 d對(duì)細(xì) 胞進(jìn)行一次傳代，細(xì)胞傳代2次以上可用于試驗(yàn)。

3 結(jié)果

三脈菝葜醇提物及其不極性萃取部位對(duì)6種腫瘤細(xì) 胞的抑制作用均呈現(xiàn)明顯的量-效關(guān)系。其中以三脈菝 葜醇提物乙酸乙酯萃取部位對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作 用最強(qiáng)，對(duì)各腫瘤細(xì)胞的IC50在40～210 μg/mL之間，其 對(duì) MCF-7 細(xì)胞的 IC50為 70.56 μg/mL，對(duì) MDA-MB-231 細(xì)胞的 IC50為 83.58 μg/mL，對(duì) HeLa 細(xì)胞的 IC50為 44.67 μg/mL，這提示三脈菝葜的抗腫瘤有效成分可能集中在 醇提物乙酸乙酯萃取部位。但與傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物順 鉑相比，三脈菝葜醇提物及其各極性萃取部位對(duì)6種腫 瘤細(xì)胞的IC50均較高。

4 討論

采用 MTT 法，考察了三脈菝葜醇提物及其不極性萃取部位對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2、人肺癌細(xì)胞株 A549、人乳腺癌細(xì)胞株 MCF-7、MDA-MB-231、人宮頸 癌細(xì)胞株HeLa和人卵巢癌細(xì)胞株HO-8910在內(nèi)的共計(jì) 6種腫瘤細(xì)胞株的增殖抑制作用，初步篩選了三脈菝葜 醇提物的抗腫瘤活性部位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三脈菝葜醇提物 乙酸乙酯萃取部位的細(xì)胞增殖抑制效果最強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯 的量-效關(guān)系，并且三脈菝葜醇提物乙酸乙酯萃取部位 對(duì)人乳腺癌細(xì)胞 MCF-7（IC50 為 70.56 μg/mL）、MDAMB- 231（83.58 μg/mL）和人宮頸癌細(xì)胞 HeLa（44.67 μg/mL）的體外增殖表現(xiàn)出較好的抑制效果，這提示三 脈菝葜抗腫瘤活性成分可能集中在三脈菝葜乙酸乙酯 萃取部位。結(jié)合相關(guān)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三脈菝葜與菝葜科 其他屬植物的抗腫瘤活性部位相一致，但三脈菝葜醇提 物乙酸乙酯萃取部位對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制效果強(qiáng)于菝葜 科其他屬植物的乙酸乙酯萃取部位（IC50大多在 100～ 300 μg/mL 之間）。